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上世紀(jì)60 年代年激光的問(wèn)世并被引入到拉曼光譜領(lǐng)域，使得拉曼光譜效應(yīng)太弱的缺陷被攻克，從而打開了拉曼光譜應(yīng)用研究的新局面。至目前，拉曼光譜已廣泛應(yīng)用于有機(jī)、無(wú)機(jī)、高分子、生物、環(huán)保等各個(gè)領(lǐng)域，成為重要的分析方法和手段。隨著科技的進(jìn)步，近幾年來(lái)又相繼發(fā)展了表面增強(qiáng)拉曼、傅里葉變換拉曼、共聚焦拉曼、顯微拉曼、紫外共振拉曼、時(shí)間分辨拉曼等新技術(shù)，拉曼光譜在分子結(jié)構(gòu)(特別是高分子結(jié)構(gòu))研究中的作用正日趨重要。特別是，由于水的散射光譜極弱，對(duì)其它物質(zhì)的拉曼散射影響甚微，拉曼光譜在水溶液方面的應(yīng)用更是具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。生物大分子多是處在水溶液環(huán)境中，因此研究它們?cè)谒芤褐械慕Y(jié)構(gòu)對(duì)于了解生物大分子的結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系很是重要。拉曼效應(yīng)對(duì)于分子構(gòu)象的變化敏感，且測(cè)量時(shí)樣品用量很少，可低至數(shù)μg，加之拉曼光譜儀本身的不斷改進(jìn)，使拉曼光譜已成為一種能夠快速、詳盡提供有關(guān)水溶液中生物大分子結(jié)構(gòu)信息的新技術(shù)。已經(jīng)有綜述總結(jié)了拉曼光譜在生物體系上的應(yīng)用方面的文章，本文重點(diǎn)針對(duì)最近五年來(lái)國(guó)內(nèi)外的最新資料尤其是生物體系與其它物質(zhì)相互作用方面的資料進(jìn)行歸納和相關(guān)總結(jié)。
1 拉曼光譜應(yīng)用于生物體系的進(jìn)展現(xiàn)狀
1.1 核酸及其組分
目前對(duì)于核酸的研究，主要集中在核酸及其組成在其它表面的吸附方式和它們與其它物質(zhì)的相互作用方面。單純研究其構(gòu)象變化的報(bào)道在近幾年已經(jīng)逐漸減少，并且轉(zhuǎn)向到在外界條件如溫度、pH、光照等的變化所引起的構(gòu)象改變的研究。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能更好地表征結(jié)構(gòu)，人們
更多的把拉曼光譜的實(shí)驗(yàn)方法和相關(guān)的計(jì)算方法緊密聯(lián)系了起來(lái)，以確證拉曼峰的歸屬。如孟耀勇利用晶格動(dòng)力學(xué)方法計(jì)算了三螺旋DNA 分子poly(dT)·poly(dA)·poly(dT)堿基振動(dòng)模式，并根據(jù)勢(shì)能分布矩陣對(duì)堿基振動(dòng)模式進(jìn)行了指認(rèn)。
1.1.1 核酸及其組分在表面的吸附方式 對(duì)于核酸及其組分在其它表面的吸附方式的研究，目前仍以表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)為主要技術(shù)手段，以金、銀的膜或電極或溶膠為主要吸附表面作為研究的重點(diǎn)。拉曼光譜特別是SERS 譜不僅能提供樣品在表面的吸附活性位點(diǎn)，而且能提供吸附
機(jī)制以及吸附方式隨環(huán)境條件的變化而變化的信息。氫鍵在堿基吸附于表面過(guò)程中起了決定性的作用：既通過(guò)氫鍵吸附于表面之上，又通過(guò)氫鍵的競(jìng)爭(zhēng)從表面解吸。而較低濃度下，核糖則是DNA 在銀溶膠中的吸附活性部位。這些物質(zhì)在表面上的吸附取向因條件特別是電位的變化而變化，如尿嘧啶在銀表面的吸附取向是由其濃度和銀表面電位共同決定的，在較低濃度和較高電位時(shí)，Ｎ(3)去質(zhì)子化的尿嘧啶離子在銀表面主要是通過(guò)Ｃ(2)及整個(gè)嘧啶環(huán)上的π電子體系與銀表面的相互作用平躺地吸附；在較高濃度和較低電位時(shí)，吸附取向發(fā)生改變，即主要是通過(guò)Ｎ(3)與Ｏ(10)以及Ｎ(3)與Ｏ(8)垂直地共同吸附在銀表面上。董麗琴等對(duì)金基體上自組裝寡聚核苷酸探針雜交前后進(jìn)行電化學(xué)非現(xiàn)場(chǎng)及現(xiàn)場(chǎng)表面增強(qiáng)拉曼光譜研究的結(jié)果表明，雜交形成的dsDNA 在基體表面以A 型和B 型兩種構(gòu)象同時(shí)存在，雜交過(guò)程可能伴隨DNA 鏈在基體表面吸附取向的變化，且ssDNA 及dsDNA 的大多數(shù)SERS 譜帶強(qiáng)度隨電極電位正移而降低，尤其是歸屬于堿基A 的兩種面外振動(dòng)模式，譜帶變化更為明顯。利用SERS 表面選擇定則判斷出隨著電極電位由負(fù)向正變化，ssDNA 及dsDNA 螺旋吸附取向由垂直吸附向平躺吸附于金基體表面變化。
1.1.2 核酸與其它物質(zhì)相互作用機(jī)理 核酸與其它物質(zhì)反應(yīng)機(jī)理的研究，對(duì)于尋找抗癌藥物或闡明藥用機(jī)理以及毒理等方面都有極其重要的意義，這也是近幾年拉曼光譜在生物體系研究上的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。眾多研究表明，藥物與DNA 的反應(yīng)主要是通過(guò)藥物的配體、雜環(huán)等部位與DNA 的插層反應(yīng)完成的。王樹玲等用表面增強(qiáng)拉曼光譜研究了小檗堿與小牛胸腺DNA 的相互作用。在Ag 膠體系中，可能是小檗堿分子的異喹啉部分鍵合到 DNA 的小溝槽，與DNA 的相互作用模式主要是通過(guò)靜電力及疏水相互作用。目前，化學(xué)類藥物與核酸反應(yīng)的拉曼光譜研究就藥物品類來(lái)說(shuō)已經(jīng)比較廣泛，但對(duì)生物物質(zhì)與核酸反應(yīng)的拉曼光譜研究還有待加強(qiáng)。
1.2 蛋白質(zhì)及其組分
目前對(duì)蛋白質(zhì)及其組分的研究正處于熱點(diǎn)時(shí)期。就拉曼光譜方向而言，研究的焦點(diǎn)一是單獨(dú)研究其光譜特征以及在其它表面吸附的拉曼光譜，二是研究它們與其它物質(zhì)的相互作用過(guò)程和方式。
1.2.1 蛋白質(zhì)及其組分的拉曼光譜特征 掌握氨基酸及其衍生物晶體的光譜特征對(duì)于研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)及反應(yīng)極具意義。低于295K 的低溫條件下，部分氨基酸晶體的拉曼振動(dòng)歸屬得以解決，且低溫下一定的溫度變化范圍內(nèi)，氨基酸或其衍生物的晶體(或單晶)會(huì)發(fā)生相的轉(zhuǎn)換甚至發(fā)生結(jié)構(gòu)的二次變化。Silva 等在室溫下利用拉曼光譜發(fā)現(xiàn)L-蘇氨酸晶體在不同壓力(20.3～22.4kPa)間發(fā)生了相的轉(zhuǎn)換，伴隨著這種轉(zhuǎn)換，其光譜的振動(dòng)區(qū)域、波數(shù)-壓力曲線以及各波段的相對(duì)強(qiáng)度均發(fā)生突變，尤其是相關(guān)的氫鍵。Ramaswamy 等通過(guò)對(duì)鳥氨酸硝酸鹽晶體的FT-IR和FT-Raman 光譜研究發(fā)現(xiàn)，羰基是以COO－離子的方式存在于晶體中，晶體中N－H…O 氫鍵的形成對(duì)晶體的內(nèi)聚力作了顯著的貢獻(xiàn)。但是目前各種氨基酸單晶的拉曼譜圖尚不完善。
對(duì)蛋白質(zhì)分子的拉曼光譜研究，所采用的對(duì)象主要有病毒蛋白、酶蛋白、血紅蛋白、角蛋白和它們的配合物等，用以探索蛋白質(zhì)分子在其它表面上的吸附機(jī)制、結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化以及分子內(nèi)部的鍵的振動(dòng)等。蛋白分子與銀表面產(chǎn)生化學(xué)吸附而產(chǎn)生拉曼增強(qiáng)，增強(qiáng)機(jī)制主要為分子增強(qiáng)，但芳香族氨基酸側(cè)鏈的π-電子復(fù)合物和分子基團(tuán)的σ-復(fù)合物的存在，使增強(qiáng)具有短程特性；相應(yīng)譜帶的拉曼增強(qiáng)效果與分子基團(tuán)處于銀表面的幾何狀態(tài)有關(guān)，且a 螺旋構(gòu)象更容易通過(guò)N 原子吸附于膠體表面。
分析氨基酸殘基、二硫化物聯(lián)橋、酰胺I 和III 帶等構(gòu)象敏感拉曼波段，是了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化、配體對(duì)構(gòu)象的影響等信息的重要手段。Thomas 等研究了氨基酸側(cè)鏈局部相互作用的氫鍵，解決了在X 射線和核磁共振理論中都不容易理解的半胱氨酸的巰基氫鍵
(SOH…X)的特性和強(qiáng)度，并揭示出天然蛋白質(zhì)中迄今尚未被承認(rèn)的巰基氫鍵的多樣性。pH 對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大的影響，可以用來(lái)探索蛋白分子折疊過(guò)程，但是蛋白質(zhì)分子對(duì)pH 變化的敏感程度并不一樣。Zhao 等利用紫外共振拉曼光譜(UVRR)所得的與酪氨酸和色氨酸殘基相關(guān)的信號(hào)差異確定了血紅蛋白異構(gòu)化過(guò)程中的三種動(dòng)力學(xué)相位。利用419nm 脈沖泵將CO 加合物進(jìn)行充分光分解，得到229nm 探針脈沖作用下產(chǎn)生的一系列時(shí)間延遲的UVRR 光譜，得出相應(yīng)的異構(gòu)化時(shí)間，并用該方法研究了化學(xué)交聯(lián)對(duì)血紅蛋白異構(gòu)化的影響，結(jié)果表明化學(xué)交聯(lián)加速
了異構(gòu)化中的一個(gè)中間轉(zhuǎn)化過(guò)程。
1.2.2 蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)相互作用機(jī)理 蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)相互作用也是近幾年研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，這對(duì)于探索病變及免疫機(jī)理，找尋特效藥物等都具有極其重要的意義。首先是反應(yīng)位點(diǎn)的確定。異吡嗪環(huán)容易接受到自配體遷移來(lái)的電荷，使其拉曼振動(dòng)得到選擇性增強(qiáng)，在任何反應(yīng)機(jī)制下，該增強(qiáng)區(qū)域都是親核進(jìn)攻或電子轉(zhuǎn)移的首選目標(biāo)位置，從而詳細(xì)而精確的反映了蛋白質(zhì)分子與其它分子間相互作用的反應(yīng)位點(diǎn)。在分子免疫方面，抗原與抗體之間的作用位點(diǎn)的研究也具有重要意義并取得了一定的進(jìn)展。王連英等用銀納米粒子SERS 效應(yīng)，研究了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和其鼠源單克隆抗體(單抗，AbHBsAg)的相互作用。結(jié)果表明，HBsAg 與AbHBsAg相互作用形成免疫復(fù)合物后，HBsAg 分子上的色氨酸(Trp)殘基特征振動(dòng)完全消失，表明Trp 殘基位于HBsAg 抗原分子的活性區(qū)，是HBsAg 與AbHBsAg 相互作用的重要位點(diǎn)。
活性復(fù)合體的構(gòu)造常常對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物有重大影響。這對(duì)更好地在分子水平理解反應(yīng)機(jī)理來(lái)說(shuō)是個(gè)至關(guān)重要的信息。在所有的分子手段中，拉曼光譜可能是最方便提供這種信息的。蛋白質(zhì)分子在一些特異的高親合結(jié)合部位發(fā)生配位作用形成配合物，如某些金屬離子和蛋白的N 末端強(qiáng)結(jié)合部位發(fā)生強(qiáng)配位作用, 或者這些金屬離子與肽鍵上的C=O 及邊鏈羧基上的C=O 配位，都將引起構(gòu)象突變；由于氫鍵的作用或者由于連接在b 型結(jié)構(gòu)邊沿上的表面環(huán)的構(gòu)象發(fā)生變化等原因，都將在一定程度上修改蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(使b 平面構(gòu)型和a 平面構(gòu)型數(shù)量關(guān)系發(fā)生變化)，但變化決定于配基的種類和性質(zhì)。Noto 等為了更好地理解Al(Ⅲ)是如何改變蛋白酶的生物學(xué)特征，利用拉曼和FT-IR 法研究了Al(Ⅲ)和胰蛋白酶相互作用的結(jié)果，結(jié)果表明Al(Ⅲ)改變了胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是在溶液中該蛋白質(zhì)和鋁離子的反應(yīng)導(dǎo)致了直立結(jié)構(gòu)百分含量的減少和平面結(jié)構(gòu)百分含量的增加，并且是隨意纏繞的。這些研究既可用于病理或毒理的探索，也可用于藥物的開發(fā)，從而為人類的健康事業(yè)和科學(xué)的進(jìn)步作出貢獻(xiàn)。
1.3 生物組織
以拉曼光譜直接研究生物組織是近幾年拉曼光譜研究領(lǐng)域的重大突破，對(duì)于更加快捷、準(zhǔn)確進(jìn)行疾病的分子診斷具有重要意義。目前所報(bào)道的研究對(duì)象已經(jīng)涉及多個(gè)組織。
皮膚是人體最大的組織，在拉曼光譜研究中頗受青睞。Petersen 等對(duì)古埃及木乃伊不同部位的皮膚作了拉曼光譜研究，為考古學(xué)提供了新的參考依據(jù)。大腦皮質(zhì)和紋狀體在梗塞前后的拉曼光譜表現(xiàn)出較大的差異，證明用該方法研究組織的生物大分子功能基團(tuán)的分布是可行的。帕金森病與腦中央喙體的塞梅林氏神經(jīng)節(jié)有直接的關(guān)系，處理過(guò)的和未經(jīng)處理的塞梅林氏神經(jīng)節(jié)的拉曼光譜表明神經(jīng)原核質(zhì)的染色過(guò)程影響了腦細(xì)胞。Erckens 等用共聚焦拉曼光譜技術(shù)監(jiān)控了兔角膜非侵入性藥至水合變化過(guò)程，觀察到角膜中水容量的變化。通過(guò)計(jì)算水羥基在3390cm-1 的振動(dòng)和蛋白質(zhì)中CH 在2945cm-1 處的拉伸振動(dòng)的拉曼強(qiáng)度比率來(lái)確定角膜的水合狀態(tài)。這種方法有可能監(jiān)控到活的角膜的水合狀態(tài)。此外，心包膜組織、血紅細(xì)胞、成骨細(xì)胞、植物的芽孢等也都在研究之中。
人體肺組織的拉曼光譜圖
b 為人體肺組織，深色部表示癌變細(xì)胞；a 為b 中九個(gè)樣點(diǎn)的相應(yīng)的拉曼光譜圖
采用拉曼光譜來(lái)進(jìn)行疾病特別是癌癥的分子現(xiàn)場(chǎng)診斷目前也取得了一定的突破。對(duì)光譜作多元統(tǒng)計(jì)分析后構(gòu)建光譜診斷模型來(lái)區(qū)分癌變后和癌變前的人體組織，使拉曼光譜具有提供真時(shí)間現(xiàn)場(chǎng)診斷癌癥等疾病的可能。唐偉躍等利用拉曼光譜儀得到了胃竇部正常組織和癌變組織的拉曼光譜。發(fā)現(xiàn)由于胃癌組織中細(xì)胞核內(nèi)的DNA 增多，細(xì)胞核肥大，核仁數(shù)增加；同時(shí)細(xì)胞中Ｃ＝Ｃ－以及－ＣＨ2 的雙鏈上接有不飽和基團(tuán)或電負(fù)性基團(tuán)的數(shù)量增多，導(dǎo)致拉曼光譜中屬于磷酸二酯基團(tuán)中PO22－對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶的1089cm－1 線比正常組織的明顯增強(qiáng)，分別來(lái)源于脫氧核糖中－ＣＨ2 彎曲振動(dòng)譜帶、DNA 胸腺嘧啶中CH3 的對(duì)稱變角振動(dòng)譜帶和DNA 腺嘌呤、鳥嘌呤中的Ｃ＝Ｃ－(接有電負(fù)性基團(tuán)或極性基團(tuán))的1459cm－1 線發(fā)生分裂。特別是Kaminaka 等利用新型的InP/InGaAsP 多波段檢測(cè)器，開發(fā)并發(fā)展一套近紅外拉曼光譜系統(tǒng)，獲得了正常的和癌變的肺組織的拉曼光譜(如上圖)，其中1～4 對(duì)應(yīng)肺組織深色部分(已經(jīng)發(fā)生癌變)的的拉曼光譜，6～9 對(duì)應(yīng)淺色部分(正常組織)的拉曼光譜，而5 為前兩者邊界的拉曼光譜。另外對(duì)乳癌、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病與鼻咽組織的癌變的拉曼光譜診斷也有研究。
2 展望
拉曼光譜應(yīng)用于生物體系的研究，特別是在DNA、蛋白質(zhì)及其與其它分子相互作用的研究方面取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，這在今后的短時(shí)間內(nèi)依然是研究的熱點(diǎn)。對(duì)單個(gè)細(xì)胞及其內(nèi)部變化與其它體系包括其它細(xì)胞相互作用的研究現(xiàn)在也有人開始進(jìn)行研究，這將成為另一個(gè)研究的重
點(diǎn)。在利用拉曼光譜作疾病的分子診斷方面，目前還只能算剛起步，在后期的研究中必然有更多更精確更完美的檢測(cè)器問(wèn)世，讓拉曼光譜的這一功能得到進(jìn)一步完善，也會(huì)有更多的病變體系被納入到研究的范疇中。
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