咨詢服務熱線
010-82464939
誠信 創(chuàng)新 共贏
致力于中國分析儀器事業(yè)發(fā)展，助力民族科技進步
上世紀60 年代年激光的問世并被引入到拉曼光譜領域，使得拉曼光譜效應太弱的缺陷被攻克，從而打開了拉曼光譜應用研究的新局面。至目前，拉曼光譜已廣泛應用于有機、無機、高分子、生物、環(huán)保等各個領域，成為重要的分析方法和手段。隨著科技的進步，近幾年來又相繼發(fā)展了表面增強拉曼、傅里葉變換拉曼、共聚焦拉曼、顯微拉曼、紫外共振拉曼、時間分辨拉曼等新技術，拉曼光譜在分子結構(特別是高分子結構)研究中的作用正日趨重要。特別是，由于水的散射光譜極弱，對其它物質的拉曼散射影響甚微，拉曼光譜在水溶液方面的應用更是具有得天獨厚的優(yōu)勢。生物大分子多是處在水溶液環(huán)境中，因此研究它們在水溶液中的結構對于了解生物大分子的結構與性能的關系很是重要。拉曼效應對于分子構象的變化敏感，且測量時樣品用量很少，可低至數μg，加之拉曼光譜儀本身的不斷改進，使拉曼光譜已成為一種能夠快速、詳盡提供有關水溶液中生物大分子結構信息的新技術。已經有綜述總結了拉曼光譜在生物體系上的應用方面的文章，本文重點針對最近五年來國內外的最新資料尤其是生物體系與其它物質相互作用方面的資料進行歸納和相關總結。
1 拉曼光譜應用于生物體系的進展現狀
1.1 核酸及其組分
目前對于核酸的研究，主要集中在核酸及其組成在其它表面的吸附方式和它們與其它物質的相互作用方面。單純研究其構象變化的報道在近幾年已經逐漸減少，并且轉向到在外界條件如溫度、pH、光照等的變化所引起的構象改變的研究。為了使實驗數據能更好地表征結構，人們
更多的把拉曼光譜的實驗方法和相關的計算方法緊密聯系了起來，以確證拉曼峰的歸屬。如孟耀勇利用晶格動力學方法計算了三螺旋DNA 分子poly(dT)·poly(dA)·poly(dT)堿基振動模式，并根據勢能分布矩陣對堿基振動模式進行了指認。
1.1.1 核酸及其組分在表面的吸附方式 對于核酸及其組分在其它表面的吸附方式的研究，目前仍以表面增強拉曼散射(SERS)為主要技術手段，以金、銀的膜或電極或溶膠為主要吸附表面作為研究的重點。拉曼光譜特別是SERS 譜不僅能提供樣品在表面的吸附活性位點，而且能提供吸附
機制以及吸附方式隨環(huán)境條件的變化而變化的信息。氫鍵在堿基吸附于表面過程中起了決定性的作用：既通過氫鍵吸附于表面之上，又通過氫鍵的競爭從表面解吸。而較低濃度下，核糖則是DNA 在銀溶膠中的吸附活性部位。這些物質在表面上的吸附取向因條件特別是電位的變化而變化，如尿嘧啶在銀表面的吸附取向是由其濃度和銀表面電位共同決定的，在較低濃度和較高電位時，Ｎ(3)去質子化的尿嘧啶離子在銀表面主要是通過Ｃ(2)及整個嘧啶環(huán)上的π電子體系與銀表面的相互作用平躺地吸附；在較高濃度和較低電位時，吸附取向發(fā)生改變，即主要是通過Ｎ(3)與Ｏ(10)以及Ｎ(3)與Ｏ(8)垂直地共同吸附在銀表面上。董麗琴等對金基體上自組裝寡聚核苷酸探針雜交前后進行電化學非現場及現場表面增強拉曼光譜研究的結果表明，雜交形成的dsDNA 在基體表面以A 型和B 型兩種構象同時存在，雜交過程可能伴隨DNA 鏈在基體表面吸附取向的變化，且ssDNA 及dsDNA 的大多數SERS 譜帶強度隨電極電位正移而降低，尤其是歸屬于堿基A 的兩種面外振動模式，譜帶變化更為明顯。利用SERS 表面選擇定則判斷出隨著電極電位由負向正變化，ssDNA 及dsDNA 螺旋吸附取向由垂直吸附向平躺吸附于金基體表面變化。
1.1.2 核酸與其它物質相互作用機理 核酸與其它物質反應機理的研究，對于尋找抗癌藥物或闡明藥用機理以及毒理等方面都有極其重要的意義，這也是近幾年拉曼光譜在生物體系研究上的重點和熱點。眾多研究表明，藥物與DNA 的反應主要是通過藥物的配體、雜環(huán)等部位與DNA 的插層反應完成的。王樹玲等用表面增強拉曼光譜研究了小檗堿與小牛胸腺DNA 的相互作用。在Ag 膠體系中，可能是小檗堿分子的異喹啉部分鍵合到 DNA 的小溝槽，與DNA 的相互作用模式主要是通過靜電力及疏水相互作用。目前，化學類藥物與核酸反應的拉曼光譜研究就藥物品類來說已經比較廣泛，但對生物物質與核酸反應的拉曼光譜研究還有待加強。
1.2 蛋白質及其組分
目前對蛋白質及其組分的研究正處于熱點時期。就拉曼光譜方向而言，研究的焦點一是單獨研究其光譜特征以及在其它表面吸附的拉曼光譜，二是研究它們與其它物質的相互作用過程和方式。
1.2.1 蛋白質及其組分的拉曼光譜特征 掌握氨基酸及其衍生物晶體的光譜特征對于研究蛋白質的性質及反應極具意義。低于295K 的低溫條件下，部分氨基酸晶體的拉曼振動歸屬得以解決，且低溫下一定的溫度變化范圍內，氨基酸或其衍生物的晶體(或單晶)會發(fā)生相的轉換甚至發(fā)生結構的二次變化。Silva 等在室溫下利用拉曼光譜發(fā)現L-蘇氨酸晶體在不同壓力(20.3～22.4kPa)間發(fā)生了相的轉換，伴隨著這種轉換，其光譜的振動區(qū)域、波數-壓力曲線以及各波段的相對強度均發(fā)生突變，尤其是相關的氫鍵。Ramaswamy 等通過對鳥氨酸硝酸鹽晶體的FT-IR和FT-Raman 光譜研究發(fā)現，羰基是以COO－離子的方式存在于晶體中，晶體中N－H…O 氫鍵的形成對晶體的內聚力作了顯著的貢獻。但是目前各種氨基酸單晶的拉曼譜圖尚不完善。
對蛋白質分子的拉曼光譜研究，所采用的對象主要有病毒蛋白、酶蛋白、血紅蛋白、角蛋白和它們的配合物等，用以探索蛋白質分子在其它表面上的吸附機制、結構及結構轉化以及分子內部的鍵的振動等。蛋白分子與銀表面產生化學吸附而產生拉曼增強，增強機制主要為分子增強，但芳香族氨基酸側鏈的π-電子復合物和分子基團的σ-復合物的存在，使增強具有短程特性；相應譜帶的拉曼增強效果與分子基團處于銀表面的幾何狀態(tài)有關，且a 螺旋構象更容易通過N 原子吸附于膠體表面。
分析氨基酸殘基、二硫化物聯橋、酰胺I 和III 帶等構象敏感拉曼波段，是了解蛋白質分子結構及結構轉化、配體對構象的影響等信息的重要手段。Thomas 等研究了氨基酸側鏈局部相互作用的氫鍵，解決了在X 射線和核磁共振理論中都不容易理解的半胱氨酸的巰基氫鍵
(SOH…X)的特性和強度，并揭示出天然蛋白質中迄今尚未被承認的巰基氫鍵的多樣性。pH 對蛋白質二級結構有較大的影響，可以用來探索蛋白分子折疊過程，但是蛋白質分子對pH 變化的敏感程度并不一樣。Zhao 等利用紫外共振拉曼光譜(UVRR)所得的與酪氨酸和色氨酸殘基相關的信號差異確定了血紅蛋白異構化過程中的三種動力學相位。利用419nm 脈沖泵將CO 加合物進行充分光分解，得到229nm 探針脈沖作用下產生的一系列時間延遲的UVRR 光譜，得出相應的異構化時間，并用該方法研究了化學交聯對血紅蛋白異構化的影響，結果表明化學交聯加速
了異構化中的一個中間轉化過程。
1.2.2 蛋白質與其它物質相互作用機理 蛋白質與其它物質相互作用也是近幾年研究的重點和熱點，這對于探索病變及免疫機理，找尋特效藥物等都具有極其重要的意義。首先是反應位點的確定。異吡嗪環(huán)容易接受到自配體遷移來的電荷，使其拉曼振動得到選擇性增強，在任何反應機制下，該增強區(qū)域都是親核進攻或電子轉移的首選目標位置，從而詳細而精確的反映了蛋白質分子與其它分子間相互作用的反應位點。在分子免疫方面，抗原與抗體之間的作用位點的研究也具有重要意義并取得了一定的進展。王連英等用銀納米粒子SERS 效應，研究了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和其鼠源單克隆抗體(單抗，AbHBsAg)的相互作用。結果表明，HBsAg 與AbHBsAg相互作用形成免疫復合物后，HBsAg 分子上的色氨酸(Trp)殘基特征振動完全消失，表明Trp 殘基位于HBsAg 抗原分子的活性區(qū)，是HBsAg 與AbHBsAg 相互作用的重要位點。
活性復合體的構造常常對反應產物有重大影響。這對更好地在分子水平理解反應機理來說是個至關重要的信息。在所有的分子手段中，拉曼光譜可能是最方便提供這種信息的。蛋白質分子在一些特異的高親合結合部位發(fā)生配位作用形成配合物，如某些金屬離子和蛋白的N 末端強結合部位發(fā)生強配位作用, 或者這些金屬離子與肽鍵上的C=O 及邊鏈羧基上的C=O 配位，都將引起構象突變；由于氫鍵的作用或者由于連接在b 型結構邊沿上的表面環(huán)的構象發(fā)生變化等原因，都將在一定程度上修改蛋白質的二級結構(使b 平面構型和a 平面構型數量關系發(fā)生變化)，但變化決定于配基的種類和性質。Noto 等為了更好地理解Al(Ⅲ)是如何改變蛋白酶的生物學特征，利用拉曼和FT-IR 法研究了Al(Ⅲ)和胰蛋白酶相互作用的結果，結果表明Al(Ⅲ)改變了胰蛋白酶的二級結構，特別是在溶液中該蛋白質和鋁離子的反應導致了直立結構百分含量的減少和平面結構百分含量的增加，并且是隨意纏繞的。這些研究既可用于病理或毒理的探索，也可用于藥物的開發(fā)，從而為人類的健康事業(yè)和科學的進步作出貢獻。
1.3 生物組織
以拉曼光譜直接研究生物組織是近幾年拉曼光譜研究領域的重大突破，對于更加快捷、準確進行疾病的分子診斷具有重要意義。目前所報道的研究對象已經涉及多個組織。
皮膚是人體最大的組織，在拉曼光譜研究中頗受青睞。Petersen 等對古埃及木乃伊不同部位的皮膚作了拉曼光譜研究，為考古學提供了新的參考依據。大腦皮質和紋狀體在梗塞前后的拉曼光譜表現出較大的差異，證明用該方法研究組織的生物大分子功能基團的分布是可行的。帕金森病與腦中央喙體的塞梅林氏神經節(jié)有直接的關系，處理過的和未經處理的塞梅林氏神經節(jié)的拉曼光譜表明神經原核質的染色過程影響了腦細胞。Erckens 等用共聚焦拉曼光譜技術監(jiān)控了兔角膜非侵入性藥至水合變化過程，觀察到角膜中水容量的變化。通過計算水羥基在3390cm-1 的振動和蛋白質中CH 在2945cm-1 處的拉伸振動的拉曼強度比率來確定角膜的水合狀態(tài)。這種方法有可能監(jiān)控到活的角膜的水合狀態(tài)。此外，心包膜組織、血紅細胞、成骨細胞、植物的芽孢等也都在研究之中。
人體肺組織的拉曼光譜圖
b 為人體肺組織，深色部表示癌變細胞；a 為b 中九個樣點的相應的拉曼光譜圖
采用拉曼光譜來進行疾病特別是癌癥的分子現場診斷目前也取得了一定的突破。對光譜作多元統計分析后構建光譜診斷模型來區(qū)分癌變后和癌變前的人體組織，使拉曼光譜具有提供真時間現場診斷癌癥等疾病的可能。唐偉躍等利用拉曼光譜儀得到了胃竇部正常組織和癌變組織的拉曼光譜。發(fā)現由于胃癌組織中細胞核內的DNA 增多，細胞核肥大，核仁數增加；同時細胞中Ｃ＝Ｃ－以及－ＣＨ2 的雙鏈上接有不飽和基團或電負性基團的數量增多，導致拉曼光譜中屬于磷酸二酯基團中PO22－對稱伸縮振動譜帶的1089cm－1 線比正常組織的明顯增強，分別來源于脫氧核糖中－ＣＨ2 彎曲振動譜帶、DNA 胸腺嘧啶中CH3 的對稱變角振動譜帶和DNA 腺嘌呤、鳥嘌呤中的Ｃ＝Ｃ－(接有電負性基團或極性基團)的1459cm－1 線發(fā)生分裂。特別是Kaminaka 等利用新型的InP/InGaAsP 多波段檢測器，開發(fā)并發(fā)展一套近紅外拉曼光譜系統，獲得了正常的和癌變的肺組織的拉曼光譜(如上圖)，其中1～4 對應肺組織深色部分(已經發(fā)生癌變)的的拉曼光譜，6～9 對應淺色部分(正常組織)的拉曼光譜，而5 為前兩者邊界的拉曼光譜。另外對乳癌、冠狀動脈粥樣硬化病與鼻咽組織的癌變的拉曼光譜診斷也有研究。
2 展望
拉曼光譜應用于生物體系的研究，特別是在DNA、蛋白質及其與其它分子相互作用的研究方面取得了相當的進展，這在今后的短時間內依然是研究的熱點。對單個細胞及其內部變化與其它體系包括其它細胞相互作用的研究現在也有人開始進行研究，這將成為另一個研究的重
點。在利用拉曼光譜作疾病的分子診斷方面，目前還只能算剛起步，在后期的研究中必然有更多更精確更完美的檢測器問世，讓拉曼光譜的這一功能得到進一步完善，也會有更多的病變體系被納入到研究的范疇中。
瑞宇科技的拉曼光譜分析檢測儀是世界上先進的高集成精密拉曼光譜儀，應用于生物醫(yī)藥、食品水務、礦 山化肥、珠寶首飾、緝毒反恐、化學原料等行業(yè)的專用檢測儀器，可以現場檢測出液 體、固體、粉末及水溶液等各種形態(tài)的化學品，能夠準確的對物質成分進行快速檢測分析。設備采用先進的激光拉曼光譜分析法，集采樣、 檢測、圖譜掃描處理及數據搜索、對比、分析于一體。非破壞性采樣，無需樣品制備前處理過程，可透過塑料、玻璃容器、包裝直接采樣，被 檢物無須開封，減少污染。內置強大的拉曼光譜庫可以快速準確地識別和驗證化學物質類型，還可根據需要自行建立真實物品的檔案庫。采用高性能超低溫冷卻探測器，大大提高物質的檢出限和準確性。體積小、重量輕、易于攜帶，操作簡便快捷，高穩(wěn)定性，應用廣泛，性價比極高?！?/p>
瑞宇科技目前已推出便攜式拉曼光譜儀、科研拉曼光譜儀、拉曼光譜顯微鏡三大系列多個型號產品，歡迎用戶咨詢，電話：010-82464939，Email: sales@chnruiyu.com
