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引　言

　　竹材是一種重要的生物材料。與木材相比，不僅在宏觀形態(tài)上有巨大差別，而且在微觀結構上也表現出明顯的不同。竹材細胞與木材細胞一樣，都具有分層結構，但是竹材細胞的分層結構更為明顯而多變。壁層數量在不同竹種、不同部位有較大變異，層數最少的２～３層，最多可達１８層。由于竹子具有特殊的結構，并具有生長迅速、強度高、柔韌性好、用途廣泛等諸多優(yōu)點，學者們很早就對竹材細胞壁產生了濃厚興趣，化學物質分布就是其中一項重要的研究內容。

    竹材細胞壁化學成分分布研究以木質素分布為主，經歷了從組織水平到細胞水平的發(fā)展過程。目前對不同發(fā)育階段木質素在不同細胞組織中的沉積順序已經有了清楚的認識，但對單一細胞中木質素沉積及其分布規(guī)律的認識仍不夠深入。竹材細胞壁是由數層厚薄不同的壁層依次交替構成。這些壁層的厚度通常較小，有的在１００ｎｍ 以下，給壁層化學物質分布研究帶來了很大困難。傳統(tǒng)的光譜分析法如紫外分光光度計，可見光分光光度計，拉曼光譜等，由于光學衍射極限的限制，很難揭示化學物質在這些具有納米尺度的壁層內的分布情況。電子顯微鏡具有很高的空間分辨率，但通常需要進行化學染色或者借助其他標記方法如抗體標記等才能進行觀察，制樣復雜，操作難度大，并且易引入外部干擾因素，不能獲得原位化學分布信息。

    納米紅外技術是近幾年出現的一種化學分析手段。它將原子力顯微鏡和紅外光譜儀整合成為一個系統(tǒng)，利用原子力探針探測紅外吸收效應所產生的熱膨脹，建立紅外波長與熱膨脹的函數關系，從而突破了傳統(tǒng)紅外衍射極限的限制，能獲取納米級的化學物質原位分布信息。該技術最早由法國ＰａｒｉｓＳｕｄ大學ＡｌｅｘａｎｄｒｅＤａｚｚｉ博士領導的科研團隊開發(fā)和應用，現已在生命科學和材料科學中大量應用，尚未發(fā)現應用于植物細胞壁的研究。因此，本研究的目的是探討應用納米紅外技術研究竹材細胞壁化學物質分布的可行性，為下一步的研究工作摸索實驗技術。

1　實驗部分

1.1　材料

所用試驗材料為６年生毛竹，采自安徽黃山林場。選擇生長正常的植株，自露出地面第一節(jié)開始計數，伐倒后于第十節(jié)間中部截取厚約５ｃｍ 的竹環(huán)，保鮮膜密封，干冰儲存帶回實驗室后置于冰柜中冷凍，保存待用。

1.2　方法

1.2.1　納米紅外原理及測試方法

    本測試應用瑞宇科技的NanoIR測試系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用側面入射光模式，脈沖激光可調范圍為９００～２０００和２２３５～３６００ｃｍ－１，光譜分辨率為４ｃｍ－１，空間分辨率為２０～１００ｎｍ。試樣截取自竹壁中部，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，端部制成金字塔形，并使纖維束位于金字塔尖端。經干燥處理后，利用鉆石刀在超薄切片機上對金字塔尖的纖維束進行表面拋光，獲得一個平整的表面，然后進行納米紅外測試。

1.2.2　顯微紅外測試

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，用鎢鋼刀在滑走切片上切取包含一個完整維管束，厚度為５μｍ 的竹材橫切面切片，置于兩載玻片之間自然氣干，再置于６０ ℃烘箱內干燥１５ ｍｉｎ后，進行顯微紅外測試。測試采用傅立葉變換顯微紅外光譜儀，將大小為２０μｍ×２０μｍ 的紅外光斑聚焦到竹材纖維細胞上，在透射模式下采集細胞壁的紅外吸收譜，掃描次數１００次。

1.2.3　拉曼光譜測試

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，用鎢鋼刀在滑走切片上切取包含一個完整維管束，厚度為１０μｍ 的竹材橫切面切片，展平于載玻片中央，蒸餾水封片后立即進行拉曼光譜測試。為防止測試過程中水分喪失而對測試產生不利影響，蓋玻片四周采取樹脂涂布固封處理。

    采用共焦顯微拉曼光譜儀進行光譜采集和掃描成像。激發(fā)光為５３２ｎｍ 可見光，物鏡采用１００倍油鏡（ＮＡ＝１．４）。掃描成像試驗參數設置為采譜曝光時間０．６６ｓ，掃描步距０．３３μｍ。木質素分布以苯環(huán)的伸縮振動峰（１５９８ｃｍ－１）進行成像。纖維素分布以纖維素分子鏈ＣＨ 伸縮振動峰（２８９３ｃｍ－１）進行成像。

2　結果與討論

2.1　納米紅外光譜與顯微紅外光譜對比

    根據參考文獻，納米紅外光譜與傳統(tǒng)ＦＴＩＲ 紅外光譜具有很高的吻合度。但這些多是基于無機物或組成相對簡單有機物所獲得的結果。竹材細胞壁為多組分構成的復雜有機體，情況可能會有所差別。為了驗證納米紅外的可靠性，我們首先將其與傳統(tǒng)紅外技術進行對比。圖２和圖３分別為竹纖維的顯微紅外光譜和納米紅外光譜。紅外主要譜峰歸屬列于表１。從圖形對比來看，顯微紅外和納米紅外所獲得的譜圖存在明顯的差別，主要表現為顯微紅外在１０００～１１００ｃｍ－１波數范圍內的吸收強度顯著強于其他波數范圍內的吸收強度。而納米紅外在１７００～１７５０ｃｍ－１波數范圍具有強烈吸收，在１０００～１１００ｃｍ－１波數范圍內的吸收強度則明顯降低。

    納米紅外是依靠原子力探針探測熱膨脹來獲得測試區(qū)域的化學信息。譜峰的吸收強度與基團的濃度及振動能級有關?；鶊F的振動能級越高，數量越多，其吸收強度就越大。基團的振動能級與原子折合質量及化學鍵力常數有關，力學常數越大，折合質量越小，則振動能級就越大。常見基團的折合質量和化學鍵力學常數列于表２。１０００～１１００ｃｍ－１波數范圍是Ｃ—Ｏ 基團的特征紅外振動譜帶，１７００～１７５０ｃｍ－１波數范圍是ＣＯ 基團的特征紅外振動譜帶。兩基團的折合質量相同，但ＣＯ 的力學常數為Ｃ—Ｏ 的兩倍多，因此從振動能級來看，納米紅外中ＣＯ 的吸收強度要大于Ｃ—Ｏ 的吸收強度。從基團的濃度方面考慮，納米紅外采集的區(qū)域僅局限于針尖范圍，采樣面積小，而顯微紅外的采樣范圍數千倍于納米紅外，采樣范圍大，因此濃度差異對吸收強度的影響顯微紅外要比納米紅外小。基于以上兩個方面的原因，就出現了兩技術在上述波數范圍內吸收強度的差異。但從譜峰位置來看，兩者主要譜峰位置基本重合，說明納米紅外技術能反映竹材細胞壁的基本化學信息。

2.2  納米紅外成像

    由于納米紅外光譜與傳統(tǒng)顯微紅外光譜所反映的基團振動信息相同，因此，我們可以選擇特定的譜峰來研究化學物質在細胞壁中的分布。１５０４ｃｍ－１為木質素苯環(huán)的紅外伸縮振動峰，１７３２ｃｍ－１ 為碳水化合物的紅外伸縮振動峰，主要來源于半纖維素中木聚糖的伸縮振動，可以選擇這兩個紅外譜峰進行掃描成像，分別代表木質素和木聚糖在細胞壁中的分布，成像結果見圖４。圖４（ａ）為原子力形貌圖，清晰顯示被測細胞的形貌特征，為一兩層結構的細胞，內層寬度較大，細胞腔較小。圖４（ｂ）和圖４（ｃ）分別為該細胞木質素和木聚糖的分布情況，顏色越紅表示紅外吸收強度越大，也反映被測物質的分布濃度越大。從圖４（ｂ）中可以看出，木質素在細胞角隅和復合胞間層的濃度較高，進入次生壁后濃度減小，但在次生壁內層中的濃度變化不大。木聚糖的分布與木質素的分布規(guī)律相似，但在細胞角隅和復合胞間層與次生壁內層的濃度差異更明顯［圖４（ｃ）］。

　　拉曼光譜技術是一項發(fā)展較為成熟的技術，已廣泛用于植物細胞壁的化學成分分布研究。為了與納米紅外的成像效果作對比，我們也采用拉曼光譜對竹材纖維細胞進行了成像，結果見圖５。圖５（ａ）為測試細胞的形貌圖，細胞的層次結構不如原子力形貌圖清晰，但可以看出明顯具有一個寬度很大的壁層。圖５（ｂ）為木質素分布圖，成像譜峰選擇為木質素苯環(huán)的拉曼特征峰１５９８ｃｍ－１。木聚糖的拉曼譜峰與纖維素相重疊而無法區(qū)分，無法通過拉曼光譜來研究木聚糖在纖維細胞中的分布。我們對纖維素進行了拉曼成像。２８９３ｃｍ－１ 為ＣＨ 的拉曼伸縮振動峰，主要來源于纖維素，其在竹材細胞中的分布情況見圖５（ｃ）。從拉曼分布圖來看，木質素也是集中分布在細胞角隅和復合胞間層，進入次生壁后濃度減小［見圖５（ｂ）］。寬層內的木質素濃度除靠近復合丙間層的區(qū)域有明顯變化外，其他部位變化不大。值得注意的是，靠近細胞腔周圍，有兩圈木質素分布較為集中的窄層，木質素濃度較與其鄰近的寬層大。結合形貌圖來看，在靠近細胞腔時應該還有兩層寬度較小的壁層。纖維素集中分布在次生壁內，并且較均勻，在細胞角隅和復合胞間層分布較少［見圖５（ｃ）］。

　　對比納米紅外和拉曼光譜的成像，兩者所反映的木質素的分布規(guī)律是一致的，即從細胞角隅向細胞腔方向，木質素濃度呈減小的趨勢。但是兩者的分辨率存在一定差別，相比來說納米紅外的空間分辨率更高，能達到納米級。拉曼光譜成像在本實驗的條件下，采用５３２ｎｍ 激光為激發(fā)光源，１００倍油鏡（ＮＡ＝１．４），理論的空間分辨率為０．２３μｍ（０．６１λ／ＮＡ），設置的掃描步長為０．３３μｍ，因此實際的空間分辨率應大于３００ｎｍ。而納米紅外根據針尖尺寸和掃描步長確定，其分辨率小于２００ｎｍ，因此在分布圖上可以發(fā)現木質素和木聚糖呈現團聚狀不均勻的分布。

2.3　不同壁層的紅外光譜

    納米紅外的一大優(yōu)勢之一就是它可以同時獲得測試樣品表面的形貌結構和化學信息。利用原子力顯微鏡獲得清晰的形貌圖之后，根據需要，可以將探針精確定位到感興趣的微小區(qū)域進行納米紅外光譜采集。圖６為竹材纖維細胞多壁層結構的納米紅外光譜原位采集試驗。圖６（ａ）為被測細胞的原子力形貌圖，粗看大約為５層結構，其中寬度較大的兩個壁層特別易于辨認。圖６（ｂ）為圖６（ａ）中紅色矩形所示區(qū)域的局部放大圖。通過放大圖可以將在低倍下不能觀察到的壁層清晰地顯現出來。這些寬度不等的壁層相互結合在一起構成了竹材細胞特殊的多壁層結構。我們將納米紅外光譜的采集點設置在兩層之間的交界處，如圖６（ｂ）中的彩色矩形點所示，以研究這些壁層之間的化學性質變化。圖６（ｃ）為被測細胞的形貌示意圖，它實際為一六層結構的細胞。圖６（ｄ）為不同壁層的納米紅外光譜。從譜圖的變化來看，大致可以分為三個不同的類別。其中細胞角隅（ＣＣ）的光譜較為簡單，譜峰較少，成為一類。第１～５層（Ｌ１～Ｌ５）譜形大致相似，可看作同一類別。相比ＣＣ 的光譜而言，在１３００～１５００ｃｍ－１波數范圍出現了更多的峰，表明Ｌ１～Ｌ５ 層內的物質組成比ＣＣ復雜。第６ 層（Ｌ６）的紅外光譜譜峰也較少，但峰特別明顯，自成一類。通過不同壁層的光譜變化可以反映，在竹材的多層結構中，細胞角隅及最靠近細胞腔的壁層與其他各層之間的化學組成是不相同的，這可能與細胞角隅及細胞腔在竹材生長過程中所擔當的功能與其他壁層不同有關，說明細胞壁的化學物質是根據植物的生長需要而有規(guī)律的沉積。

3　結　論

　　竹材細胞壁納米紅外光譜與傳統(tǒng)顯微紅外光譜在９００～１０００ｃｍ－１波數和１６００～１７００ｃｍ－１波數范圍內存在明顯的譜峰吸收強度差別，但兩者的譜峰位置基本相同，表明納米紅外光譜能正確地反映細胞壁的化學信息。

    納米紅外成像所揭示的木質素分布規(guī)律與拉曼成像所反映的規(guī)律一致，但具有更高的空間分辨率，能觀察到木質素在細胞壁中具有團聚狀的不均勻分布。

    納米紅外能獲得清晰的樣品形貌，并能對目標區(qū)域進行精確定位和光譜采集，獲得納米級的紅外光譜，很適合用于具有納米尺度的細胞壁層的化學物質組成和分布研究。